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    为了阐明不同放疗剂量的不同影响，我们在最后一次放疗后1d(放疗开始后第4天)检测了t细胞浸润和细胞因子的产生。在所有被检查的队列中，4gy-rt显示在肿瘤胰岛浸润的cd8+t细胞数量最多(图2a和扩展数据图1a)，在hkp1肺中干扰素-γ+/肿瘤坏死因子-α+/cd4+t细胞和gzmb+/cd8+t细胞数量最多(图2b，c和扩展数据图1b)。这些4gy-rt诱导的t细胞活性与其抑制pd-1的协同作用是一致的。越来越多的t细胞被招募到hkp1肺部，逐渐获得功能障碍的表型，表现为cd4+t细胞的效应细胞因子表达减少，如干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α(扩展数据图2a，b)。为了确定4gy-rt是否增强了原有t细胞的功能，我们用s1p受体抑制剂fty720治疗hkp1小鼠，fty720可以阻止活化的t细胞从淋巴结流出(扩展数据图2c)。正如预期的那样，fty720治疗通过减少循环t细胞(扩展数据图2d)，将4gy-rt的效果局限于肺部原有的t细胞。与对照组相比，fty720取消了4gy-rt增加干扰素-γ+/肿瘤坏死因子-α+/cd4+t细胞和gzmb+/cd8+t细胞的能力(扩展数据图2e)。因此，在fty720处理的小鼠中，4gy-rt和抗pd-1联合治疗的效果被取消(扩展数据图2f)。这些发现表明，4gy-rt并不能重新激活tme中原有的功能紊乱的t细胞。

    4gy-rt治疗可激活tme中的肺驻留棒状细胞

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    为了探索4gy-rt诱导抗肿瘤免疫反应的机制，我们检测了rt诱导的树突状细胞(dc)的激活。4gy-rt治疗既没有引起肿瘤细胞死亡(扩展数据图4a)，也没有增加支气管淋巴结中cd103+交叉呈递的dc(扩展数据图4b)。接下来，我们对接受rt(0gy、4gy或8gy×3)联合igg或pd-1抗体治疗的hkp1肺进行rna-seq分析。比较4gy-rt组、0gy(模拟)组和8gy-rt(无效剂量)组在抗pd-1治疗前后的差异表达基因(p<0.0    1，倍增≥2和最小二乘平均≥5)。通过将igg队列中4gy-rt上调的基因与抗pd-1队列重叠，我们识别了144个特定于该有效辐射剂量上调的基因(图3a和扩展数据图5a)。为了确定这4个gy-rt特征基因的细胞来源，我们对接受0gy或4gy-rt的hkp1荷瘤肺进行了单细胞rna-seq(scrna-seq)分析。通过将144个签名基因投影到t分布随机邻居嵌入(t-sne)图，我们发现这些基因在4gy-rt后在气道上皮/棒状细胞簇中显著上调(图3b)。

    棒状细胞分泌体与联合治疗的疗效有关

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    无论采用哪种耗竭方法，携带hkp1的肺对4gy-rt的免疫反应均明显减弱，表现为t细胞向肿瘤胰岛的浸润显著减弱，效应细胞因子的产生减少(cd4+t细胞中的干扰素-γ/肿瘤坏死因子-α和cd8+t细胞中的gzmb)(图4c和扩展数据图6d)。值得注意的是，在hkp1荷瘤小鼠中，棒状细胞缺陷取消了联合治疗的疗效(图4d)。

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    电子显微镜对棒状细胞的进一步表征显示，与对照组相比，从4gy-rt治疗的肺中分离出的棒状细胞中分泌囊泡的数量增加(扩展数据图8a，b)。我们推测放疗后棒状细胞的分泌可能在提高icis疗效中起作用。为了解决这个问题，我们使用scgb1a1-creertm/snap23flox/flox转基因小鼠(简称scgb1a1cre/snap23fl/fl)阻止棒状细胞分泌蛋白进入肺tme。突触体相关蛋白23(snap23)是snare复合体的关键成分，它介导细胞内囊泡融合到膜上，调节胞吐。他莫昔芬治疗scgb1a1cre/snap23fl/fl小鼠允许有条件的棒状细胞特异性缺失snap23基因(图5a)，而不改变细支气管的完整性(扩展数据图8c)。对支气管肺泡灌洗液(balf)的分析证实，与野生型对照相比，4gy-rt治疗的scgb1a1cre/snap23fl/fl小鼠的棒状细胞分泌组成分cc10显著减少(图5b)。与棒状细胞消融一致，snap23缺乏抑制了hkp1肺对4gy-rt反应中t细胞的浸润和激活(图5c和扩展数据图8d)。

    棒状细胞减少促肿瘤炎症

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    球状细胞缺陷(dt治疗)小鼠的肺显示髓系/淋巴细胞比率增加(mye/lym，对照组和dt治疗小鼠分别为0.96和1.34，图6a)。此外，杆状细胞缺陷肺中的髓样细胞表现出炎症介质的表达增加，如il1b、ptgs2和tnf(图6b)，据报道它们可以抑制适应性抗肿瘤免疫。我们推测这些棒状细胞介导的tme改变可能影响了t细胞效应器的表型。使用基于图形的分类，t细胞被分成9个簇(图6c)，每个簇的功能状态根据它们的特征基因来确定(图6c和补充表2)。我们观察到效应t细胞簇(c5)显示细胞因子、效应分子(干扰素-γ和肿瘤坏死因子)和t细胞活化标志物(pdcd1和ctla4)表达增加，增殖t细胞簇(c9)显示颗粒酶和ki67表达，调节性t细胞簇(c8)显示foxp3和il2ra表达(图6c)。值得注意的是，与对照组(分别为2.63和1.96)相比，去杆状细胞(dt治疗)降低了效应器、增殖t细胞和treg细胞的比率((c5+c9)/c8)。总之，这些scrna-seq结果表明，rt激活的棒状细胞的存在有助于适应性抗肿瘤免疫，可能是通过限制hkp1肿瘤中髓系细胞介导的炎症。balf样本的elisa检测显示，与0gy对照组相比，4gy-rt显著降低了hkp1    tme中il-1β、pge_2和tnf-α的水平(图6d)，但在没有棒状细胞(dt处理的scgb1a1cre/idtr)或其分泌体(scgb1a1cre/snap23fl/fl)的情况下，4gy-rt未能减少这些炎症因子(图6d)。为了证明rt诱导的棒状细胞分泌体的临床相关性，我们在ii期新辅助临床试验(nct02904954)54中评估了接受rt联合icis(抗pd-l1)治疗的nsclc患者的血浆水平。分别于首次立体定向全身放射治疗(sbrt)前1d和末次sbrt后1d采集血浆。匹配患者的cc10血浆浓度比较(放疗前和放疗后)显示，大多数获得病理改善的患者在放疗后血浆cc10水平升高(8人中有5人)，而无反应的患者(9人中有0人，p=0.0301)(图6e)，表明棒状细胞激活与联合治疗的病理反应有关。综上所述，这些发现表明，rt激活的棒状细胞通过其分泌体抑制了hkp1肺中的肿瘤前炎症，从而增强了适应性抗肿瘤免疫。
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